1.同型對(duì)照：同型對(duì)照須盡可能與一抗同種屬、同亞型（IgG1/IgG2a/IgG2b/IgM）、同濃度、同標(biāo)記方式，且確認(rèn)不與靶標(biāo)結(jié)合。濃度不匹配，對(duì)照就失去意義。

2.陽性對(duì)照：陽性對(duì)照要與實(shí)驗(yàn)樣本同物種、同固定條件、同處理流程；批次穩(wěn)定、可追溯、可重復(fù)；表達(dá)譜要經(jīng)過文獻(xiàn)或表達(dá)數(shù)據(jù)庫確認(rèn)。弱陽性樣本是靈敏度的標(biāo)尺——它能染出來，說明你的體系確實(shí)夠靈敏；強(qiáng)陽性樣本用于驗(yàn)證整套染色體系完整可用，排查實(shí)驗(yàn)流程失效的情況。注意：強(qiáng)陽性易發(fā)生信號(hào)飽和，無法評(píng)估體系對(duì)低豐度靶點(diǎn)的檢出能力。免疫相關(guān)指標(biāo)常用扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等免疫細(xì)胞富集組織作為陽性對(duì)照。

3.陰性對(duì)照：生物學(xué)陰性樣本對(duì)照：選用經(jīng)文獻(xiàn)、蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫證實(shí)生理?xiàng)l件下不表達(dá)靶蛋白的組織/ 細(xì)胞，或采用CRISPR?KO 敲除靶基因的樣本。經(jīng)蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證的體外培養(yǎng)細(xì)胞系KD樣本，也可以作為WB實(shí)驗(yàn)的陰性樣本；省略一抗只是“空白對(duì)照"，只能排除二抗和檢測系統(tǒng)的背景；抗體Fc段非特異性結(jié)合要靠同型對(duì)照來排除；內(nèi)源性酶、自發(fā)熒光要靠背景對(duì)照排除。

4.陽性、陰性對(duì)照應(yīng)與待測樣本采用同一批試劑、一致的處理流程；盡量同批次染色，保證實(shí)驗(yàn)條件對(duì)等。

★核心口訣：陽性對(duì)照看體系，陰性對(duì)照看特異性，同型對(duì)照看背景，空白對(duì)照看檢測系統(tǒng)，自發(fā)熒光看本底，單色對(duì)照看光譜。